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制备型超高速离心机的几种分离方法
发布时间:2021-03-04   点击次数:115次

A.差速离心:逐次增加离心力,每次可沉降样品溶液中的一些组份。 
  差速离心是一种常用的方法。在这种方法中,离心管在开始时装满了均一的样品溶液。通过在速度下时间的离心后,就可得到两个部份:沉淀和上清液。 
  通常在次离心时把大部分不需要的大粒子沉降去掉。这时所需的组份大部分仍留在上清液中。然后将收集到的上清液以更高速度离心,把所需的粒子沉积下来。离心的时间要选择得当,使大部份不需要的更小的粒子仍留在上清液中。对于得到的沉淀和上清液可以进行进一步的离心,直到达到所需要的分离纯度为止。 
  差速离心的特点是操作简单,但分离纯度不高。 
B.密度梯度离心法:可以同时使样品中几个或全部组份分离,具有很好的分辨率。 
1)速率区带法(rate zonal): 
  根据样品中不同粒子所具有的不同的尺寸大小及沉降速度(S)。大致步骤如下: 
  在离心管中装入密度梯度溶液,溶液的密度从离心管顶部至底部逐渐增加(正梯度)。 
  将所需分离的样品小心地加至密度梯度溶液的顶部。样品在梯度溶液表面形成一负梯度。 
  由于不同大小的粒子在离心力作用下,在梯度中移动的速度不一样,所以经过离心后会形成几条分开的样品区带。 
  注意:样品粒子的密度大于梯度液注中任一点的密度。离心过程在区带到达管子底部前停止。 
2)等密度离心法(isopycnic): 
  根据粒子的不同密度来分离。离心过程中,粒子会移至与它本身密度相同的地方形成区带。 
  密度样度的选择要使梯度的范围包括所有待分离粒子的密度。样品可以在密度梯度液粒上面或均匀分布在密度梯度中。经离心后,样品粒子达到它们的平衡点。注意:平衡后粒子的分离由其密度决定,与时间无关,此时再改变离心转速,只能改变区带的相对位置。 2.密度梯度分析法 
1)梯度介质性质与选择: 
A、应具备的性质 : 
  梯度物质的选择原则是满足分离方法的基本要求,一个理想的密度材料标准它应是: 
  · 所形成的溶液密度应包括所需要的密度范围。 
  · 具有某些性质,如折射率,据此可测定它的浓度。 
  · 所形成的溶液粘度低。 
  · 不损伤所分离的样品。 
  · 离心分离后容易除去。 
  · 不妨碍分离积分的分析。 
B、常用介质种类: 
  表一、常用梯度材料在20℃密度 
B.梯度介质应用范围: 
  表二、等密度梯度介质的应用 
  +++很好 ++好 +可以 --不适用 
  表三、各种大分子在蔗糖梯度液中的大约密度 
(2)、梯度溶液的准备: 
  计算 
  稀释(本文第三章部分) 
(3)、梯度形状 
  梯度形状分:线型、等速型、阶梯型、平坦型、陡峭型指数梯度。(如下图) 
  梯度形状对于分离是否成功重要: 
  常用的是线型梯度,适用于分离蛋白质、酶、激素、核糖体亚基和一些植物病毒;等速型适用于分离脂蛋白和一些需上浮分离样品;不连续或阶梯型梯度适用于分离整细胞、亚细胞组分以及纯化一些哺乳类动物病毒或昆虫病毒。等速梯度以及长液柱可增进分离能力,适用于分离核糖体亚基、多核糖体及植物病毒。 
B.梯度柱制备: 
  梯度液柱可以用手工或梯度仪制备 
  半注法: 
  为缩减离心时间,或分离样品较少可用半注法:下半管铺置梯度介质,中间加样品,上面铺Buffer或液体石腊油。 

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